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技術(shù)支持

細胞轉染小貼士
更新時(shí)間:2024-06-24   點(diǎn)擊次數:557次

細胞轉染技術(shù)是指將外源分子如DNA,RNA等導入真核細胞的技術(shù)。隨著(zhù)分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,轉染已經(jīng)成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中,其應用越來(lái)越廣泛。影響轉染效率的因素有很多,細胞株本身的特性和活性,細胞培養條件,轉染的DNA或RNA的質(zhì)量,轉染方法,轉染試劑的選擇等。
轉染效率受多種因素影響,主要因素有下面幾個(gè):
1.轉染試劑
不同細胞系轉染效率通常不同,但細胞系的選擇通常是根據實(shí)驗的需要,因此在轉染實(shí)驗前應根據實(shí)驗要求和細胞特性選擇適合的轉染試劑。當然,zui shi he的是高效、低毒、方便、廉價(jià)的轉染試劑。
2.細胞狀態(tài)
一般低的細胞代數(<50)能確?;蛐筒蛔?。zui shi he轉染的細胞是經(jīng)過(guò)幾次傳代后達到指數生長(cháng)期的細胞,細胞生長(cháng)旺盛,最容易轉染。細胞培養在實(shí)驗室中保存數月和數年后會(huì )經(jīng)歷突變,總染色體重組或基因調控變化等而演化。
3.轉染方法
轉染時(shí)應跟據具體轉染試劑推薦的方法,但也要注意,因不同實(shí)驗室培養的細胞性質(zhì)不同,質(zhì)粒定量差異,操作手法上的差異等,其轉染效果可能不同,應根據實(shí)驗室的具體條件來(lái)確定最佳轉染條件。
(1)細胞培養物
不同細胞有不同的培養基,血清和添加物。高的轉染效率需要一定的細胞密度,一般的轉染試劑都會(huì )有專(zhuān)門(mén)的說(shuō)明。推薦在轉染前24小時(shí)分細胞,這將提供正常細胞代謝,增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細菌,支原體或真菌的污染。
(2)細胞密度
不同的轉染試劑,要求轉染時(shí)的最適細胞密度各不相同,即使同一種試劑,也會(huì )因不同的細胞類(lèi)型或應用而異。因此如果選用新的細胞系或者新的轉染試劑,最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗并為以后的實(shí)驗建立一個(gè)穩定方法,包括適當的接種量和培養時(shí)間等等。陽(yáng)離子脂質(zhì)體具有微量的細胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細胞數,有的要求細胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間,總之是盡導致和轉染相關(guān)的細胞行為的變化。
(3)血清
轉染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天,對于主流的轉染試劑來(lái)說(shuō),血清的存在已經(jīng)不會(huì )影響轉染效率,甚至還有助于提高轉染效率,如陽(yáng)離子聚合物等,血清的存在會(huì )影響DNA一轉染復合物的形成,但只要在DNA-轉染復合物形成時(shí)用無(wú)血清培養基或PBS來(lái)稀釋DNA和轉染試劑就可以了,在轉染過(guò)程中是可以使用血清的。不過(guò)要特別注意:對于RNA轉染,如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的。胎牛血清(FCS)經(jīng)常用到,便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。
(4)抗生素
目前轉染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的*培養基來(lái)操作,非常方便,省去了污染等麻煩。
(5)氮磷(N/P)比
N/P比是轉染效率的關(guān)鍵(為了換算方便,一般以DNA/轉染試劑質(zhì)量比表示),在一定比例范圍內轉染效率隨N/P比成比例增高,之后達到平值,但毒性也隨之而增加,因此在實(shí)驗之前應根據推薦比例,確定本實(shí)驗的最佳轉染比例。
(6)DNA質(zhì)量
DNA質(zhì)量對轉染效率影響非常大。一般的轉染技術(shù)(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理,如果DNA不純,如帶少量的鹽離子,蛋白,代謝物污染都會(huì )顯著(zhù)影響轉染復合物的有效形成及轉染的進(jìn)行。
4.載體構建
轉染載體的構建(病毒載體,質(zhì)粒.DNA,RNA,PCR產(chǎn)物,寡核苷酸等)也影響轉染結果。病毒載體對特定宿主細胞感染效率較高,但不同病毒載體有其特定的宿主,有的還要求特定的細胞周期,如逆轉錄病毒需侵染分裂期的宿主細胞,此外還需考慮一些安全問(wèn)題(如基因污染)。除載體構建外,載體的形態(tài)及大小對轉染效率也有不同的影響,如前面提到的超螺旋及線(xiàn)性DNA對瞬時(shí)和穩定轉染的影響。如果基因產(chǎn)物對細胞有毒性作用,轉染也很難進(jìn)行,因此選擇組成或可調控,強度合適的啟動(dòng)子也很重要,同時(shí)做空載體及其它基因的相同載體構建的轉染正對照可排除毒性影響的干擾。



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